1.  引言

帕金森病 (PD) 是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺( dopamine，DA) 能神經(jīng)元進(jìn)行性變性丟失，導(dǎo)致紋狀體 DA 水平下降，在臨床上主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)平衡障礙等癥狀。 

PD 的病因?qū)W具有多因素，包括氧化應(yīng)激和腦鐵失調(diào)。目前的化學(xué)療法基本上是使用外源性左旋多巴 (LD)（DA 的直接前體）作為藥物進(jìn)行對(duì)癥治療。然而，LD 給藥與三個(gè)重要問(wèn)題有關(guān)：

① LD 代謝可產(chǎn)生細(xì)胞毒性自由基，破壞尚未受損的黑質(zhì)紋狀體的多巴能神經(jīng)元，可加速帕金森病的發(fā)展；

② LD 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生物利用度較低；

③ 在長(zhǎng)期治療期間，給藥后 LD 的血藥濃度波動(dòng)明顯，進(jìn)而導(dǎo)致大腦內(nèi)突觸間隙的多巴胺水平波動(dòng)劇烈，對(duì)突觸后多巴胺受體造成脈沖樣刺激，從而導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥的出現(xiàn)。

為了克服這些問(wèn)題，最近合成了一種含有 LD 和天然硫辛酸部分（LA）的多功能前藥（LD-LA，圖 1）。硫辛酸很容易穿過(guò)血腦屏障 ( BBB ) 并在神經(jīng)元中積累，具有抗氧化和鐵螯合特性，可以減少兒茶酚胺的自動(dòng)氧化（由過(guò)渡金屬加速）和清除 LD 代謝產(chǎn)生的 ROS 。 

LD-LA 對(duì)帕金森病癥狀的活性及其抗氧化效率已通過(guò)體外和體內(nèi)研究得到證明。此外，與 LD 相比，口服 LD-LA 延長(zhǎng)了 LD 血藥濃度，因此這種前藥在治療與 LD 血漿水平波動(dòng)直接相關(guān)的運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥特別有益。然而，LD-LA 兒茶酚酯和酰胺鍵在化學(xué)和酶促作用下均被裂解，導(dǎo)致血漿半衰期約為 50 分鐘。因此，每天需要多次給藥以保持 LD 的有效腦水平。

在目前的工作中，將不穩(wěn)定的前藥 LD-LA 包埋在可生物降解的聚合物微球中，以保護(hù)該前藥免受酶促和化學(xué)降解，并獲得完整化合物的持續(xù)釋放。聚乳酸-羥基乙酸( PLGA ) 具有良好的生物相容性和可生物降解性，用于制備載有前體藥物的微粒。因此，它已被用于開(kāi)發(fā)低分子量化合物以及治療性蛋白質(zhì)和質(zhì)粒 DNA 的持續(xù)藥物制劑。

由于 LD-LA 的親脂特性，PLGA 微球采用水包油乳液/溶劑蒸發(fā)法配制。研究了配方和加工參數(shù)對(duì)微球特性（大小、負(fù)載、釋放）的影響。還強(qiáng)調(diào)了藥物釋放前后的穩(wěn)定性以及控制 LD-LA 釋放的潛在傳質(zhì)機(jī)制。

4.  儀器設(shè)備

AccuSizer顆粒計(jì)數(shù)器

品牌：美國(guó)PSS（Entegris），AccuSizer A7000系列

原理：單個(gè)粒子通過(guò)狹窄的光感區(qū)時(shí)阻擋了一部分入射光，引起到達(dá)檢測(cè)器的入射光強(qiáng)度瞬間降低，強(qiáng)度信號(hào)的衰減幅度理論上與粒子橫截面(假設(shè)橫截面積小于光感區(qū)的寬度)，即粒子直徑的平方成比例。用標(biāo)準(zhǔn)粒子建立粒徑與強(qiáng)度信號(hào)大小的校正曲線。儀器測(cè)得樣品中顆粒通過(guò)光感區(qū)產(chǎn)生的信號(hào)，根據(jù)校正曲線計(jì)算出顆粒粒徑。PSS（Entegris）的SPOS單粒子光學(xué)傳感技術(shù)，通過(guò)光散射增加對(duì)小粒子的靈敏度，將單顆粒傳感器的計(jì)數(shù)下限拓展至0.5μm。A7000AD 采用自動(dòng)稀釋模式，可有效將高濃度樣品快速稀釋至合適濃度并進(jìn)行檢測(cè)。

檢測(cè)關(guān)鍵點(diǎn)：濃度、稀釋液/分散液性質(zhì)、流速。

原理圖	儀器外觀

3.  樣品制備及表征

通過(guò)油包水乳液/溶劑蒸發(fā)技術(shù)(O/W，ESE)制備了LD-LA PLGA微球(Wischke和Schwendeman，2008)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將 PLGA 和 LD-LA 以不同的濃度和藥物/聚合物比例(PLGA/mL DCM 為200、400、800 mg/mL DCM；藥物/聚合物比例為2%、5%或20%(w/w))溶解在DCM中，可制得 0.5 mL的油相。

對(duì)于聚合物濃度較高的溶液，在室溫下超聲處理 30 min。使用均質(zhì)機(jī)，將 o-ph 與含 PVA 2%(w/w)的水相( aq-ph )乳化(30 s，室溫，25000分鐘)。將得到的乳液滴入PVA水溶液(0.5% (w/w))中;2.5 或 5 ml)，硬化浴( hb )，在室溫下磁力攪拌兩小時(shí)，使DCM蒸發(fā)和微球凝固。或者，在不稀釋的情況下攪拌乳液(表1)。在室溫(3min，3000×g)下離心收集微球，然后用水洗兩次，用液氮迅速冷凍，冷凍一夜進(jìn)行干燥。

使用 AccuSizer A7000 AD 對(duì)微球粒徑分布進(jìn)行表征分析，使用顯微鏡掃描電鏡（SEM）對(duì) AccuSizer 測(cè)量的微球粒徑大小結(jié)果進(jìn)行佐證。

4.  實(shí)驗(yàn)結(jié)果

該實(shí)驗(yàn)考察了配方參數(shù)(聚合物在有機(jī)溶劑中的濃度、相體積比、有機(jī)溶劑蒸發(fā)速率)對(duì)微球粒徑大小的影響。表 1 顯示，PLGA 濃度的增加導(dǎo)致微球尺寸和多分散性增加(例如比較 F2 和 F4)。這些現(xiàn)象可歸因于油相粘度的增加導(dǎo)致攪拌效率的降低，從而產(chǎn)生多分散和更大的乳化液滴，從而產(chǎn)生尺寸范圍相當(dāng)寬的微球。

為獲得可儲(chǔ)存的注射劑，通常粒徑范圍控制在20-100 μm，上述所有的配方都達(dá)到目標(biāo)粒徑范圍。微球的多分散性與乳液基的制備技術(shù)相關(guān)。Accusizer 測(cè)量（圖 2）表明，使用 200 mg PLGA/mL 的 DCM 溶液制備的微球具有相當(dāng)窄的粒徑分布，而隨著聚合物濃度的增加 (800 mg/mL)，粒徑范圍變寬。 

使用具有高 PLGA 濃度 (800 mg/mL) 的 DCM 溶液制備的顆粒是無(wú)孔的，且與 AccuSizer 數(shù)據(jù)（圖 2）一致，顯示出相當(dāng)寬的粒徑分布（圖 3，F(xiàn)8）。

5.  結(jié)論

關(guān)鍵配方和加工參數(shù)會(huì)影響微球的粒徑大小和孔隙率，從而影響藥物釋放速率。有機(jī)相中的聚合物濃度、相體積比和水相與有機(jī)溶劑的預(yù)飽和度對(duì)攪拌效率和油滴凝固速率具有重要影響，從而影響微球粒徑大小、多分散性和孔隙率。使用AccuSizer A7000 系列可快速、準(zhǔn)確測(cè)量粒徑大小和粒徑分布、從而篩選配方，節(jié)省研發(fā)時(shí)間。

參考資料

[1] E. D’Aurizio, C.F. van Nostrum, M.J. van Steenbergen, P. Sozio, F. Siepmann, J. Siepmann,W.E. Hennink, A. Di Stefano；Preparation and characterization of poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres loaded with a labile antiparkinson prodrug.